DNAJB11促进卵巢颗粒细胞中FOXL2诱导的雌激素合成

摘要：目的 转录因子FOXL2是颗粒细胞雌激素合成与颗粒细胞功能维持的关键调控分子,但目前尚不清楚FOXL2蛋白的表达及功能调控机制.文章旨在鉴定调控FOXL2蛋白功能的新分子.方法 通过分离小鼠卵巢组织进行免疫组化染色检测DNAJB11的表达定位情况,含有全长DNAJB11基因cDNA序列(Ad-DNAJB11-Flag和Ad-Flag-DNAJB11)的腺病毒载体按AdMax系统(Microbix)方法进行病毒颗粒的包装.按NE-PERTM Nuclear and Cytoplasmic抽提试剂盒所述方法进行细胞核质蛋白的分离.KGN细胞感染不同浓度腺病毒(Ad-DNAJB11和Ad-LacZ),测量波长450 nm的吸光度值,进行细胞增殖检测.采用Access Immunoassay System 2化学发光自动检测系统(Beckman Coulter)检测细胞培养上清中雌二醇的浓度.采用PCR方法扩增含有人FOXL2和人DNAJB 11基因的全长cDNA序列,并分别亚克隆至pCS2-6XMT载体(Myc-FOXL2)和pFLAG-CMV2载体(Flag-DNAJB11)中.采用Lipofectamine 2000转染试剂将Myc-FOXL2和Flag-DNAJB11表达质粒瞬时转染至细胞HEK-293细胞中.收集HEK-293细胞或FSH处理的KGN细胞的裂解液,进行FOXL2和DNAJB11的免疫共沉淀实验.通过细胞免疫荧光染色和荧光素酶报告基因等实验检测内质网Hsp40/DnaJ家族成员DNAJB11调控颗粒细胞的雌激素水平.结果 Western blot表明DNAJB11蛋白在人卵癌颗粒细胞KGN、小鼠原代卵巢颗粒细胞mGC以及小鼠卵巢中高表达,免疫组化染色结果亦证实DNAJB11蛋白表达于小鼠卵巢的卵母细胞质中,并在窦前卵泡、排卵前卵泡的颗粒细胞中持续表达.免疫荧光染色和Western blot分析亦表明外源性激素FSH可以诱导KGN细胞中内源性DNAJB11蛋白从内质网转移到细胞核中.腺病毒介导的DNAJB11-Flag过表达定位于细胞内质网中,但当Flag标签阻断DNAJB11信号肽功能时,外源Flag-DNAJB11过表达则定位于颗粒细胞的细胞核,内质网中DNAJB11-Flag蛋白高表达以浓度依赖的方式减少KGN细胞中雌二醇的合成,与Ad-LacZ(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)减少,KGN细胞中雌二醇的合成[(10749.0±801.7)pg/mL vs(79030.±409.5)pg/mL,P<0.01],而细胞核中高表达Flag-DNAJB11后则刺激KGN细胞中雌二醇的生成,与Ad-LacZ(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)刺激雌二醇的生成[(10749.0±801.7)pg/mL vs(14217.0±1218.0)pg/mL,P<0.01].免疫共沉淀实验表明当Myc-tagged FOXL2与Flag-tagged DNAJB11分别共转染HEK 293细胞,FOXL2与DNAJB11可以相互免疫共沉淀对方,荧光素酶报告基因实验进一步表明细胞核中表达的DNAJB11显著增强FOXL2介导的Cyp19A1启动子活性和Cyp19A1蛋白表达.结论 DNAJB11是转录因子FOXL2新的结合分子并调控FOXL2蛋白的稳定性与转录活性.