赖氨酸特异性去甲基化酶1对曲古抑菌素A诱导卵巢癌细胞凋亡的作用

摘要：目的 赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)是黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的胺氧化酶,其参与细胞的增殖、分化以及介导基因激活和抑制等多种生物学过程.文中旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对LSD1的乙酰化,以及LSD1在TSA诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用.方法 利用RNA干扰方法建立诱导型稳定敲低LSD1基因表达的卵巢癌HO8910和SKOV3细胞株;实验设置pLKO对照组(感染空载体慢病毒)、pLKO+Dox(100 ng/mL)组、LSD1-KD组(感染LSD1-shRNA慢病毒)和LSD1-KD+Dox(100 ng/mL)组.用免疫沉淀(IP)和Western blot检测LSD1乙酰化程度,及其底物组蛋白H3第4位赖氨酸的二甲基化(H3K4me2)水平;AnnexinⅤ/PI和流式细胞术分析细胞凋亡的变化;RT-PCR检测凋亡相关基因Bax和p21 mRNA表达水平;染色质免疫沉淀(ChIP)分析Bax和p21基因启动子区H3K4me2程度.实验设置methanol对照组(2 mg/mL)、TSA组(200 nmol/L)、TCP组(抑制LSD1活性;100μmol/L)和TSA+TCP组,处理细胞48 h.在RNA干扰LSD1表达实验中,设置溶剂对照组(2 mg/mL methanol)、TSA处理组(200 nmol/L)、Dox组(干扰LSD1表达;100 ng/mL)和联合处理组(200 nmol/L TSA与100 ng/mL Dox)联合处理细胞48 h.结果 免疫沉淀结合Western blot检测结果显示,200 nmol/L TSA处理后LSD1蛋白的乙酰化和H3K9的乙酰化水平较methanol溶剂处理显著增加(P<0.01).与methanol溶剂对照处理比较,200 nmol/L TSA处理HO8910和SKOV3细胞后H3K4me2水平明显升高(P<0.01).AnnexinⅤ/PI结果显示,与methanol对照组比较,TSA组、TCP组和TSA+TCP组HO8910和SKOV3细胞的总凋亡率均显著升高(P<0.05);且TSA+TCP组较TSA组和TCP组细胞凋亡率明显升高(P<0.05).LSD1-KD+Dox组细胞中LSD1蛋白水平(HO8910:0.21±0.16;SKOV3:0.26±0.11)较pLKO对照组(HO8910:1.15±0.16;SKOV3:0.97±0.31)和LSD1-KD组(HO8910:1.07±0.19;SKOV3:0.98±0.21)显著减少(P<0.01).与溶剂对照组比较,TSA处理组、Dox组和联合处理组细胞的总凋亡率均显著增高(P<0.05);其中联合处理组较TSA或Dox组亦显著增高(P<0.05).RT-PCR结果表明,在HO8910细胞中,与溶剂对照组Bax和p21 mRNA水平比较,TSA处理组、Dox组及联合处理组均显著上调(P<0.05);且联合处理组较TSA处理组或Dox组亦显著上调(P<0.05).TSA处理组细胞中Bax和p21基因启动子区H3K4me2水平较methanol对照组显著升高(Bax:2.92±0.26 vs 0.86±0.19;p21:3.07±0.29 vs 0.93±0.17,P<0.01).结论 TSA诱导了LSD1蛋白的乙酰化,抑制LSD1表达或活性可增强TSA对卵巢癌细胞的杀伤作用.